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羅氏KAPA2G DNA聚合酶—PCR界的多、快、好、省

轉自羅氏診斷生命科學公眾號

 

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一種用于放大擴增特定DNA片段的分子生物學技術,其核心就是DNA聚合酶。目前分子生物學領域中很多都是使用野生型的DNA聚合酶,如Taq DNA聚合酶等天然形式存在的酶。野生型的Taq聚合酶由于本身的結構導致功能有限,經常會遇到如擴增效率低,特異性差,啟動速度慢,模板GC含量異常等擴增不出的問題。隨著新興技術的發展,對DNA擴增酶的需求越來越高,能否進行快速擴增、能否有效擴增復雜樣本、能否進行多重擴增成為DNA擴增酶亟待解決的問題。

2018年,來自加州理工學院的Frances H. Arnold教授因為“酶的定向進化”這一領域的貢獻,獲得諾貝爾化學獎。定向進化允許對酶功能進行持續改進,例如提高熱穩定性、比活性、持續合成能力或對抑制劑的抗性。Roche旗下Kapa Biosystems成功利用其定向進化技術(Directed evolution technology platform)設計出KAPA2G快速熱啟動DNA聚合酶。KAPA2G快速熱啟動DNA聚合酶是抗體介導的熱啟動聚合酶,具有更高的擴增性能和速度。其具有1 s/kb的延伸速度,相比于野生型Taq DNA聚合酶1min/kb的擴增速度,能夠極大地縮短總循環時間。在具有強大的擴增速度下,KAPA2G快速熱啟動DNA聚合酶同時具有相當強大的“耐受”能力,面對粗制樣本、GC異常樣本均具有優秀的擴增能力。另外在多重擴增方面也表現優秀。針對當前PCR面臨的“快速、穩健和多重”的痛點,KAPA2G系列分別能夠提供KAPA2G Fast、KAPA2G Robust和KAPA2G Multiplex三種類型的產品,真正是PCR里的多、快、好、省。

 

 

 

KAPA2G系列產品適合的應用:
 

多重PCR擴增
 
 
法醫學檢測
 
 
多重擴增毛細管電泳檢測
 
 
宏基因組測序mNGS
 
 
病原靶向測序tNGS
 
 
遺傳病多重擴增檢測
 

 

“多”重

—KAPA2G Fast HS Multiplex

KAPA2G Fast HS Multiplex試劑盒包含KAPA2G快速熱啟動DNA 聚合酶。除了具有快速擴增速度外,KAPA2G Fast HS Multiplex還能提供更高的產量和靈敏度,與高度多重的PCR。

 

高通量測序現在已經廣泛用于病原微生物和腫瘤檢測,但是不同起始樣本質量參差不齊,部分樣本中某些基因豐度太低,直接進行建庫測序可能導致結果不準確甚至出現漏檢。斯坦福大學的Zhang1等人利用KAPA2G Fast HS Multiplex進行測序前的預擴增,能夠將樣本中靶基因豐度提升1000倍左右,有效的提高整體檢測準確性和完整度。另外NGS測序的結果驗證同樣重要,目前常用的方法是進行RT-PCR驗證,常見的RT-PCR一次只能檢測一到二個基因。Miljani´c2等利用KAPA2G Fast HS Multiplex建立多重RT-PCR技術—mRT-PCR(Multiplex),能夠對測序結果進行快速高效驗證。病原靶向測序技術是一種新型技術,將超多重PCR擴增與高通量測序兩種技術結合,可以對待測樣本中幾十種至幾百種的目標基因進行檢測。這種方法的提前就是需要DNA擴增酶具有強大的多重擴增能力。Franken3等利用KAPA2G Fast HS Multiplex的超多重擴增能力,建立了一種基于靶向基因多重擴增高通量測序的方法,用于提高乳腺癌的靶向治療。

 

圖A:使用KAPA2G Fast Multiplex進行快速多重PCR可以節省 40 – 60% 的時間。

圖B:使用KAPA2G Fast Multiplex進行GC豐富的多重PCR(6 重)實驗,能夠有效擴增全部目標片段。

數據來源:羅氏診斷實驗室整理

 

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KAPA2G Fast Multiplex特點:

 

01

 

節省時間

預混液無需過多優化,對多重PCR體系縮短循環時間高達60%

02

 

強勁多重性能

KAPA2G Fast Multiplex對應對富含GC或AT序列的靶標均具有優秀性能,同時對體系中超多重靶標擴增具有優秀均一性

 

 

“快”速

—KAPA2G Fast

KAPA2G Fast試劑盒是一款旨在解決快速PCR的產品。相比于野生型Taq聚合酶,其有用更高的合成能力和速度。除了超快的擴增速度,KAPA2G Fast還提供能夠具有更高的擴增效率和擴增能力。

 

圖A:KAPA2G Fast HotStart聚合酶有效擴增5個不同大小的人基因片段,其中延伸時間為1秒/循環。

圖B:使用野生型Taq DNA聚合酶和KAPA2G Fast DNA聚合酶擴增人基因組DNA (≤3.5 kb) 和lambda (≤5 kb)不同長度片段的總反應時間,反應時間基于試劑盒推薦的35循環程序。

數據來源:羅氏診斷實驗室整理

 

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KAPA2G Fast特點:

 

01

 

節省寶貴時間

延伸時間可達到1秒/kb,減少PCR反應時間達75%

02

 

應對復雜模板

覆蓋高AT和高GC含量的靶標

03

 

持續提升PCR反應的開發

熱啟動和即用型制式

 

 

“好”擴

—KAPA2G Robust

KAPA2G Robust試劑盒通過更高的合成速率和特異性賦予PCR更加強健的表現、更高的靈敏度和更好的常規反應抑制劑耐受能力。KAPA2G Robust試劑盒適用于復雜困難樣本類型等具有挑戰性的PCR應用,無需在酶類選擇和反應方案層面的過多優化。

 

進行PCR反應過程中是常常會遇到模板異常的情況,比如粗制提取,含有各種PCR抑制物,或者GC豐度異常的樣本,這類型樣本在進行高通量測序時難以直接進行建庫,非??简灲◣霥NA酶擴增能力。TERT(telomerase reverse transcriptase)啟動子突變的檢測是診斷膠質母細胞瘤的關鍵因子,然而TERT啟動子的GC含量在80%以上,一般的DNA聚合酶難以進行擴增。Ward4等利用KAPA2G Robust對模板高GC的耐受能力,成功擴增TERT啟動子并開展下游的測序工作。

 


 


 

圖A:使用KAPA2G Robust和野生型Taq 聚合酶,在四種常見PCR抑制劑存在的條件成功擴增出從1pg質粒DNA擴增1.5kb片段。

圖B:使用KAPA2G Robust對72種不同GC含量的PCR產物進行擴增。

數據來源:羅氏實驗室整理

 

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KAPA2G Robust特點:

 

01

 

輕松應對粗提樣本

KAPA2G Robust對抑制劑殘留和粗提樣本PCR有很高的耐受能力(例如FFPE樣本)

02

 

在具有挑戰性的應用中實現高靈敏度

每單位酶呈現高得率

03

 

提升復雜困難樣本的 PCR 表現

應對富含GC和AT序列的靶標并且減少您的反應優化時間

 

 

“省”心

—羅氏診斷的品質保證

羅氏生命科學部的工業原料產品作為羅氏產品大家族中的一員,秉承了羅氏公司一貫堅持的高品質特性,為各生產企業、大型研究所、研發中心等提供上佳的原料來源,包括分子診斷、臨床生化、免疫檢測和生物制藥等各應用領域。除了高品質的產品外,提供高水準的產品服務和技術服務也是羅氏診斷致力追求的目標。我們期待著和您攜手共進,贏向未來。

 

產品

規格

貨號

KAPA2G Fast HS

12500U

7983239001

KAPA2G

Robust Hotstart

Ready Mix預混液

12.5mL

08041113001

KAPA2G Fast HS

Multiplex預混液

50mL

09077898001


參考文獻:

 
  1. Zhang R, Li X, Ramaswami G, et al. Quantifying RNA allelic ratios by microfluidic multiplex PCR and sequencing. Nature methods, 2014, 11(1): 51-54.

  2. Miljani? V, Jakše J, Rusjan D, et al. Small RNA Sequencing and Multiplex RT-PCR for Diagnostics of Grapevine Viruses and Virus-like Organisms. Viruses, 2022, 14(5): 921.

  3. Franken A, Rivandi M, Yang L, et al. A multiplex PCR-based next generation sequencing-panel to identify mutations for targeted therapy in breast cancer circulating tumor cells. Applied Sciences, 2020, 10(10): 3364.

  4. Ward D G, Baxter L, Gordon N S, et al. Multiplex PCR and next generation sequencing for the non-invasive detection of bladder cancer. PloS one, 2016, 11(2): e0149756.

 

*不用于臨床診斷。MC-CN-02503 有效期至2025年11月8日。
 

END

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